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DNA银商老子有钱分析与老子有钱
1、DNA银商样品用什么溶液溶解比较好?
  答:溶解DNA银商样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的银商反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的 酶反应条件.如果DNA用老子有钱液溶解后,在进行了银商反应时,DNA溶液中的老子有钱液组份会影响银商反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。
  有很多客户在溶解DNA银商样品时使用TE Buffer。的确,TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性,但TE Buffer对DNA银商反应有影响,根据我们的经验,我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA银商样品。

2、老子有钱DNA银商样品时,老子有钱何种形态的比较好?
  答:我们推荐客户老子有钱菌体,由我们来提取质粒,这样DNA样品比较稳定。
  如果您要以老子有钱DNA样品,我们也很欢迎,但一定要注意样品纯度和数量。 老子有钱的银商样品为PCR产物时,特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收,否则无法得到良好的银商。有关DNA银商样品的详细情况请严格参照“银商模板的要求”部分的说明。

3、老子有钱的银商样品为菌体时,以什么形态老子有钱为好?
  答:一般菌体的形态有:平板培养菌、穿刺培养菌,甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌 或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便,我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎,面目全非,需要用户重新寄样。这样既误时间,又浪费客户的样品。一 旦是客户非常重要的样品时,其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。
  制作穿刺菌时,可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基,把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月,并且不容易污染,便于运送。

4、与银商银商有关的问题:
  答:对于通用银商银商,只要正确使用,一般不会有太大问题,银商银商问题主要发生在客户自己老子有钱的PCR银商上。应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的银商都可以用来作银商,以下几种PCR银商将是不适合用作银商银商的:
(1)简并银商
  简并银商必然要在银商模板上有多个结合位点,直接影响银商结果。
(2)随机银商,如RAPD银商
  随机银商一般都比较短,所用退火温度低,在银商反应的条件下,不能很好地与模板结合。
(3)过长的银商,一般要求银商银商不大于24bp,最长不能超过30bp
  过长的银商在银商反应的较低的条件下容易在银商模板上有多个结合位点,导致银商结果背景较长的银商纯度也将难以保证。通常用于银商的银商纯度要在90%以上,银商纯度低时,银商反应的背景将明显增大,直接影响到银商结果。
(4)有特殊标记的银商
  该情况主要指荧光标记的银商。我们银商反应的四种碱基都是荧光标记的,这样,荧光标记的银商将产生干扰。另外,其他一些有大的标记基团的银商也最好不要用于银商。银商上大的标记基团将直接影响到DNA片段的迁移率,导致银商结果峰型不好或错误。
(5)不纯的银商
  银商银商对纯度的要求很高,老子有钱的银商中非全长的片段可以造成较强的背景。以一个20bp的银商银商为例,直接脱盐纯化的话,纯度至多在70%左右,也就是说将有30%的银商将作为背景噪音,这必将严重影响银商结果。 一般经PAGE或OPC法纯化的银商基本能达到银商的要求。
5、怎样选择(设计)银商用银商?
  答:银商用银商要求非常严格,不同于PCR用银商。PCR用银商一般只要能和模板结合,3’端的几个碱基能完全配对,即使银商长达80~100多个碱基,只要调整PCR反应条件,也能成功进行PCR反应。 而银商用银商便不一样了,必须严格符合以下要求。本公司的银商用银商全用银商设计软件Primer设计。在本公司银商时,我们可免费帮助设计银商用银商。  
  (1)长度在15~25个碱基左右,一般选择20个碱基(根据GC含量作适当调整),
  (2)3’端尽量选择G或C碱基(但不绝对),以增加与模板的结合能力。
  (3)Tm温度应选择50℃~70℃左右。
  (4)GC含量应选择在50%左右,尽量避开A、T、G、C的连续结构。
  (5)避开银商自身形成发夹结构或银商二聚体结构等复杂结构。
  (6)保证银商和模板100%匹配,特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证银商和模板之间只能有一个结合位点。

6、PCR片段直接银商和PCR片段经克隆后银商的结果有何区别?
  答:众所周知,PCR圹增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接银商时,其结果是PCR片段众多老子有钱的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数老子有钱(或许是几十万个老子有钱)在这个点上应该还是正确的,在银商时,错配现象也就是反映不出来了。因此,PCR片段直接银商的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后银商是测定了某一个老子有钱的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个老子有钱的任何点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的银商结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接银商的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶。

7、银商结果不到800Bases,还照常收费了,为什么?
  答:如在DNA样品中的DNA序列分布匀称,没有复杂结构时,正常的银商反应能保证达到800Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,银商信号突然减弱或消失,或者银商结果出现套峰现象,出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成(公司保证进行2次以上的银商工作)。
在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成银商结果紊乱,出现套峰。
  一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢?现在还没有这方面的报道。根据我们的经验,这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰,但有时60~70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。
  一般来说,PCR片段直接银商时,A或T的连续结构后面的序列银商结果都会出现套峰。原因在于银商时经历了PCR反应及银商反应(银商反应本身也是PCR反应)二次聚合酶的打滑现象。
   (3)原因不明的复杂结构,银商结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看,DNA碱基排列并无特别异常。 估计是DNA整体出现复杂结构,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。

8、出现套峰的原因是什么?
  答:在银商反应中,模板或银商的原因都可能造成套峰的形成,归结其形成原因有以下几点:
  (1)银商银商在模板上有两个结合位点形成套峰;
  (2)模板不纯,如果是质粒或是菌液,原因是非单克隆,如果是PCR,原因为非特异性条带;
  (3)模板序列的特殊结构,如poly结构、发卡结构等;
  (4)银商降解,银商不纯,或银商的特异性不好。

9、我为什么找不到我的PCR银商?
  答:以下几种情况,我们将无法找到做PCR时的银商序列
  (1)用PCR银商作为银商银商进行银商时,所银商列是从银商3’末端后第一个碱基开始的,所以自然就找不到您的银商序列了。有两种方法可以得到您的银商序列。对于较短的PCR产物(<800bp),可以用另一端的银商进行银商,从另一端银商可以一直测到序列的末端,就可以在序列的末端得到您的银商的反向互补序列。对于较长的序列,一个银商反应测不到头,因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中,用载体上的通用银商进行银商。由于载体上的通用银商与您的插入序列之间还有一段距离,因此就可以得到您的完整的银商序列。由于在银商的起始端总会有一些碱基无法准确读出,因此,您如果想得到您的PCR产物的完整序列,最好克隆后进行银商。
  (2 PCR产物用T载体克隆后,由于克隆的方向是随机的,因此,当您在一条链上找不到您的银商序列时,试图在互补链上寻找您的银商序列。
  (3)当银商银商离您的插入片段很近时,有时可能也无法找到您的银商的全序列。这主要是因为有时银商的起始端由于未去除的染料或银商二聚体的干扰,造成起始区的序列不好,可能无法找到您的银商完整序列。
  (4)有时,质粒做模板进行银商时,由于某些原因,质粒上没有插入外援片段,为空载列完全为载体序列,此时自然也找不到银商序列。
10、我的基因序列与标准序列为什么有差别?
  答:一段基因序列经扩增后,克隆到载体中进行银商。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在PCR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次,银商的准确率问题。ABI公司承诺其老子有钱的银商精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于老子有钱准确率的限制,在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下,通过双向银商可以最大限度减少银商的错误。您如果想得到您的最准确的序列,进行双向银商是很有必要的。只进行简单的单向银商,我们无法保证所银商列的完全准确性,这是由老子有钱的精度决定的。

11、过短的PCR产物为什么不适于直接银商?
  答:首先过短的PCR产物纯化困难,一般的PCR产物纯化app盒都要求PCR产物片段大于150bp,过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于银商的PCR产物一般不低于150bp长度。其次,由于银商技术本身的限制,银商反应对环境的干扰比较敏感,模板太短干扰更大,很容易造成银商失败。

12、用银商的方法检测点突变可靠吗?
  答:有的客户想用银商的方法检测点突变体,我认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先,我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。银商反应的信号强度直接与模板的量有关,如果突变的模板所占的比例很少,将直接作为背景噪音了,很难检测出来。只有当银商反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时,才能较可靠地检测到突变体的存在。其次,在同一位置,不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时,也不一定能准确检测到突变的存在。另外,银商仪是设计用来银商正常的碱基序列的,软件在对扫描的结果进行处理时,会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低,以得到尽可能好的结果。因此,当某处出现双峰时,银商仪一般会认为信号弱的峰为背景信号,在处理过程中,将弱的峰进一步压低,这样根部不立于突变体的检测。因此认为,用银商的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。

13、我要求5’到3’正向银商,为什么你们给我的序列是反的?
  答:您指的可能是插入片段的方向,而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的序列来确定银商方向,所以在银商银商一栏中请不要使用3’银商和5’银商这样的字样,因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反,请以T7,T3,SP6,M13f,M13r这样的形式来填写,或注明酶切位点方向比如“银商方向EcoRI到HindIII”。我们手中等质粒资料有限,有时还需要您老子有钱质粒的相关资料。

14、我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问,能否重新测一次?
  答:我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置,如果从银商报告上的确无法作出准确判读,我们会重新进行上万。如果您指出的位点信号清晰准确,您仍然要求再进行一次上万,那么上万结果和验证上万是相同的。

15、我的样品送银商前已经鉴定过了,有插入片段的,为什么你给我的银商结果是一个空质粒?
  答:造成这种现象主要有两个原因。
  (1)鉴定过程中的假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR和酶切两种方式鉴定。由于PCR反应受多种条件的影响,在鉴定过程中易产生假阳性,而酶切鉴定是比较可靠的鉴定方式。
  (2)我们由于条件的限制,无法单独的对某一个客户的样品进行特定条件的培养,所以可能在培养过程中发生插入片段的丢失。由于这种情况的发生无法事先预期到,所以我们也只能对出现这样情况的客户说抱歉。直接老子有钱质粒虽然可以避免这样的情况,但由于质粒制备上的问题,银商的成功率可能会受到影响。

16、DNA片段很长,一个反应读不到头,怎么办?
  答:如果DNA片段在载体上,可以用载体上两端的银商同时银商,让其中间交叉互补,便可完全测通。如果这样还读不通,可在已经测出序列的450~500个碱基处设计银商银商作进一步银商(此称为Primer Walking法),便可完全银商。

17、我的样品你们已经测通了,但为什么在overlap区有这么多的错配,给出的全序列和单个报告也称作差异,我该相信谁?
  答:给出的全序列是一个拼接的结果,当互相拼接的两个序列存在差异时,应该以序列质量更好的应该为主,这也就是为什么会出现错配和全序列与单个银商结果的差异。

18、你们为什么在primer walking时总将银商设计的那么靠前?
  答:我们在设计银商时有两个准则。一是设计银商区域的序列必须准确,二是在银商区后必须还有足够的准确序列以便拼接。这样我们设计银商的位置就必然比较靠前,在满足软件设定的条件下,我们总会选取最靠近3’端的银商来作为最终的银商银商。

19、我有一个4KB的PCR片段,希望你们帮我测通。
  答:大于2KB的PCR片段要测通最好是构建好克隆后再进行银商。这样模板更加稳定,银商效果也更加好一些。

20、银商完成后,银商样品和银商将如何处理(或保存)? 
  答:客户需要将银商样品或银商(客户自带的)返还时,我们在发送银商报告的同时,按客户要求关注样品或银商(客户自带的)。对于没关注的银商样品和银商,公司负责保存1个月(从样品收到之日算起),超过1个月还需银商的样品,请客户另行老子有钱。

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